miRNA pull down實驗簡介
miRNA pull-down是研究目標miRNA與其他RNA或RNA結(jié)合蛋白（RBPs）之間相互作用的技術(shù)。
體外miRNA pull-down：首先合成生物素標記的miRNA探針（也可以是pre-miRNA或pri-miRNA探針），在體外條件下將其結(jié)合到鏈霉親和素磁珠上，再與待測樣本裂解液孵育，捕獲與miRNA結(jié)合的其他RNA（如mRNA、lncRNA和circRNA）或RBPs；提取的RNA可以采用qPCR方法檢測，洗脫的蛋白質(zhì)可以采用western-blot或質(zhì)譜（LC-MS/MS）技術(shù)檢測。
體內(nèi)miRNA pull-down：將生物素標記的miRNA探針轉(zhuǎn)染到細胞中，裂解細胞后，采用鏈霉親和素磁珠捕獲樣本裂解液中的生物素miRNA-RNA復(fù)合物；隨后，洗脫純化得到RNA，并進行高通量測序或qPCR檢測。
輝駿生物10年科研服務(wù)經(jīng)驗，專業(yè)提供分子互作實驗服務(wù)，包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術(shù)，經(jīng)驗豐富，實驗結(jié)果穩(wěn)定、可靠。
我公司自有分子、細胞和質(zhì)譜實驗平臺，能執(zhí)行最優(yōu)的實驗路線，對微量互作蛋白的質(zhì)譜鑒定有充足把控力，對后續(xù)功能分析有獨到見解。
我們不僅會提供專業(yè)的售前方案建議、而且售后技術(shù)支持將一直保持到文章發(fā)表，確保您安心進行下游實驗及投稿。
目前，客戶已在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology (IF: 40.4)、European Heart Journal (IF: 35.7）、Molecular Cancer (IF: 33.9）、Cell Discovery (IF: 33.5）、Nature Methods (IF: 32.1）等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章（點擊查看客戶文獻）。
miRNA pull down實驗流程
圖一：miRNA pull-down調(diào)取結(jié)合蛋白原理圖
圖二：miRNA pull down調(diào)取結(jié)合RNA原理圖
miRNA pull-down應(yīng)用背景
MicroRNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一種長約21~23個核苷酸的RNA分子。miRNA的產(chǎn)生也是一個高度調(diào)控的多步驟過程。首先，攜帶miRNA信息的基因被轉(zhuǎn)錄成初級miRNA（pri-miRNA），再被Drosha復(fù)合體剪切成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA），最后被Dicer復(fù)合體進一步切割，產(chǎn)生成熟的miRNA。成熟的miRNA與Argonaute蛋白等組裝形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），常常特異性結(jié)合靶RNA（例如mRNA、lncRNA、circRNA）并調(diào)控其表達。
每個miRNA可以有多個靶基因，而幾個miRNAs也可以調(diào)節(jié)同一個基因，并且這種調(diào)控是動態(tài)變化的。此外，從miRNA的生成、轉(zhuǎn)運到發(fā)揮功能，都需要很多蛋白質(zhì)的參與。因此，研究miRNA與RNA、蛋白質(zhì)的結(jié)合對揭示很多生物學現(xiàn)象具有重要意義。
miRNA pulldown實驗—輝駿生物服務(wù)內(nèi)容
| 服務(wù)項目 | 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實驗周期 | 客戶提供 | 價格
|
體外miRNA Pull-down qPCR | 合成生物素miRNA探針 | 探針合成報告 | 5-6周 |
miRNA序列 待測RNA序列 實驗樣本 |
|
| qPCR檢測樣本中的待測靶RNA | Input qPCR檢測結(jié)果 |
miRNA pull-down捕獲miRNA-靶RNA復(fù)合體并檢測 （實驗組、對照組） | pull-down qPCR檢測結(jié)果 pull-down實驗報告 |
體內(nèi)miRNA Pull-down qPCR | 合成生物素miRNA探針 | 探針合成報告 | 7-8周 |
miRNA序列 待測RNA序列 待轉(zhuǎn)染細胞及其培養(yǎng)方法 |
|
qPCR檢測樣本中的待測靶RNA | Input qPCR檢測結(jié)果 |
| miRNA探針轉(zhuǎn)染細胞 | pull-down qPCR檢測結(jié)果 pull-down實驗報告 |
miRNA pull-down捕獲miRNA-靶RNA復(fù)合體并檢測 （實驗組、對照組）
|
體外miRNA Pull-down WB
| 合成生物素miRNA探針 | 探針合成報告 | 5-6周 | miRNA序列 待測RNA序列 待測蛋白序列 待測蛋白抗體 | |
| Western blot（WB）檢測樣本中的待測靶蛋白 | Input WB檢測結(jié)果 |
miRNA pull-down捕獲miRNA-靶蛋白復(fù)合體并檢測 （實驗組、對照組） | pull-down WB檢測結(jié)果 pull-down實驗報告 |
| 體外miRNA Pull-down MS | 合成生物素miRNA探針 | 探針合成報告 | 6-7周 | miRNA序列 實驗樣本 |
|
miRNA pull-down捕獲miRNA-靶蛋白復(fù)合體 （實驗組、對照組） | pull-down產(chǎn)物SDS-PAGE圖 pull-down實驗報告 |
LC-MS/MS檢測和數(shù)據(jù)分析
| 質(zhì)譜檢測結(jié)果和報告 互作蛋白篩選表格 |
| 生物信息學分析（GO、KEGG pathway、String） | 生物信息學分析結(jié)果和報告 |
miRNA Pull-down樣本要求
1. 送樣量要求
樣本類型
| miRNA pull down WB/qPCR建議送樣量 | miRNA pull down MS建議送樣量 |
動物細胞
| 2*10e7個細胞/組（約2個10cm皿） | 3*10e7個細胞/組（約3個10cm皿） |
| 動物組織 | 1g/組 | 2g/組 |
▲注意：以上均為每組樣本的送樣量，如果實驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細送樣指南可聯(lián)系輝駿生物索取。
2. 樣本運輸要求
（1）樣本一定要做好標記，應(yīng)用油性防凍記號筆或標簽紙在管上注明樣本名稱或編號；
（2）樣本較多或需要分批做，要將樣本分裝；
（3）干冰取樣/運輸；需要至少在送樣前一天通知我方。
miRNA Pull Down結(jié)果示例
miRNA pull down WB檢測圖（陽性）
miRNA pull down qPCR檢測結(jié)果（陽性）
miRNA pull-down參考文獻
實驗熱線：4006991663
