Q：IP、Co-IP、Pull-down的應(yīng)用是什么？

Co-IP：體內(nèi)條件下，研究蛋白間的相互作用；

Pull-down：體外條件下，研究蛋白間的相互作用；大多是用來鑒定或者是識別相互作用比較強(qiáng)的蛋白質(zhì)。

IP是利用特異性抗體將樣品中的靶蛋白沉淀（收集）下來；

Co-IP在IP實(shí)驗中維持目標(biāo)蛋白與互作蛋白的結(jié)合狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)二者共同沉淀收集；依目標(biāo)蛋白不同分兩類：內(nèi)源蛋白Co-IP，通常需IP級別抗體；外源蛋白Co-IP（標(biāo)簽蛋白Co-IP），適用于IP級別抗體不佳或內(nèi)源蛋白表達(dá)量低的情況，需構(gòu)建帶標(biāo)簽的目的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。

Pull-down是將帶GST、His等標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白結(jié)合于樹脂/磁珠，通過蛋白標(biāo)簽-配體親和作用純化目標(biāo)蛋白，再與樣本裂解液孵育，捕獲其中的互作蛋白。

IP/Co-IP多用組織細(xì)胞材料，靶蛋白為內(nèi)源天然/過表達(dá)蛋白（可融合標(biāo)簽）；Pull-down誘餌蛋白多為重組表達(dá)。IP/Co-IP需高親和力一抗，選購關(guān)注驗證數(shù)據(jù)。簡言之，IP捕獲目的蛋白，Co-IP捕獲目的蛋白及互作蛋白，Pull-down以帶標(biāo)簽重組蛋白捕獲互作蛋白。

IP實(shí)驗流程：提取組織/細(xì)胞裂解液，與誘餌蛋白抗體、Protein A/G Beads依次共孵育，經(jīng)漂洗液清洗去除未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫誘餌蛋白，最終通過WB或質(zhì)譜檢測洗脫液中蛋白。

內(nèi)源蛋白Co-IP流程：提取組織/細(xì)胞裂解液，與誘餌蛋白抗體、Protein A/G Beads依次共孵育，經(jīng)漂洗液多次清洗去除未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫誘餌-互作蛋白復(fù)合體，最終通過WB或質(zhì)譜檢測洗脫液中的蛋白。

標(biāo)簽蛋白Co-IP流程：取含誘餌蛋白與互作蛋白的裂解液，與標(biāo)簽抗體磁珠孵育結(jié)合，經(jīng)漂洗液清洗去未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫誘餌-互作蛋白復(fù)合體，洗脫液蛋白用WB或質(zhì)譜檢測。

做IP實(shí)驗常遇抗體磁珠孵育洗脫后，WB出現(xiàn)抗體輕重鏈雜帶的痛點(diǎn)，雜帶易掩蓋目的互作蛋白條帶，導(dǎo)致結(jié)果難解讀、實(shí)驗失敗。推薦科研神器——標(biāo)簽納米抗體磁珠，羊駝來源的納米抗體為單鏈結(jié)構(gòu)，分子量約15kD，無傳統(tǒng)抗體重輕鏈，從根源解決輕重鏈污染問題，且成本低、親和力佳，助力獲得優(yōu)質(zhì)IP實(shí)驗結(jié)果！

圖7 納米抗體磁珠無抗體輕重鏈的IP結(jié)果示意圖

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Pull-down實(shí)驗流程：體外表達(dá)帶標(biāo)簽誘餌蛋白，與親和介質(zhì)孵育純化后，和樣本裂解液共孵育，經(jīng)漂洗液清洗去未結(jié)合蛋白，加洗脫液洗脫誘餌-互作蛋白，洗脫液蛋白用WB或質(zhì)譜檢測。

文獻(xiàn)實(shí)例：CoIP和Pulldown驗證2個蛋白的互作，并確定結(jié)合位點(diǎn)

免疫共沉淀結(jié)果顯示，人源高分化肝癌細(xì)胞系中PRMT1與FBXO7存在相互作用，該發(fā)現(xiàn)揭示了潛在的全新細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，為研究細(xì)胞內(nèi)互作關(guān)系提供重要線索。

圖9 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Flag-AATF全長及截短體質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其全長與XRCC4互作；構(gòu)建截短體驗證結(jié)合結(jié)構(gòu)域，證實(shí)缺失331-380氨基酸片段后XRCC4條帶消失，確定該區(qū)域為二者互作靶點(diǎn)。此結(jié)構(gòu)域的明確，為解析AATF與XRCC4互作分子機(jī)制提供核心依據(jù)，助力探究二者協(xié)同參與的細(xì)胞生理/病理進(jìn)程，為后續(xù)機(jī)制研究和靶向策略開發(fā)奠定重要基礎(chǔ)。

圖10 引自Elevated nonhomologous end-joining by AATF enables efficient DNA damage repair and therapeutic resistance in glioblastoma. Nat Commun 16(1):4941(2025). 

pull down 實(shí)驗結(jié)果表明，在293T細(xì)胞中觀察到了GSNOR與NEDD4之間的直接相互作用。 這一實(shí)驗證據(jù)證實(shí)了兩種蛋白的體外結(jié)合關(guān)系，為后續(xù)解析其在細(xì)胞內(nèi)的功能關(guān)聯(lián)與調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵支撐。

圖11 引自[輝駿客戶文章] NEDD4-Mediated GSNOR Degradation Aggravates Cardiac Hypertrophy and Dysfunction. Circ Res 136(4):422-438(2025). 

GST下拉實(shí)驗證實(shí)，大腸桿菌純化的重組GST-USP5與PD-1存在相互作用。研究者構(gòu)建USP5不同結(jié)構(gòu)域缺失截短體探究互作關(guān)鍵區(qū)域，結(jié)果顯示，相較USP5-WT或ΔZnF-UBP，同時缺失UBA1和UBA2的USP5 ΔUBA1/2突變體完全喪失與PD-1的互作能力，證實(shí)USP5通過UBA1、UBA2結(jié)構(gòu)域與PD-1結(jié)合。該結(jié)構(gòu)域的鑒定，為解析二者互作分子機(jī)制提供核心依據(jù)，也為后續(xù)探究其參與的細(xì)胞生理/病理進(jìn)程、開發(fā)靶向調(diào)控策略奠定重要基礎(chǔ)。

圖12 引自ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitinationto modulate tumor immunotherapy. Nat Commun 14(1):2859(2023).

輝駿生物Co-IP、GST pull-down客戶文章

客戶結(jié)果呈現(xiàn)：IP-WB結(jié)果表明，使用輝駿生物的磁珠在樣品中獲得了單一清晰的靶蛋白條帶，且富集效率高，具備卓越的特異性 （Flag-GPX4與HA-OTUB1免疫共沉淀結(jié)果）

客戶結(jié)果呈現(xiàn)：使用輝駿生物的GST pull-down試劑盒下拉分析，表明GST-DSS1與LC3B的存在直接的相互作用。

輝駿生物納米抗體磁珠及IP試劑盒

輝駿生物pull-down純化樹脂及試劑盒